DNT, həyat üçün lazım olan genetik təlimatları daşıyan uzun molekulyar zəncirlərdən ibarətdir. Gen mühəndisliyində tədqiqatçılar diqqətlə seçilmiş yerlərdə DNT-ni kəsir və həmin hissələri digər DNT ardıcıllıqları ilə birləşdirirlər. Bu proses təkmilləşdirilmiş bitki yetişdirilməsi, genetik xəstəliklərin müalicəsi və dərmanların hazırlanmasında istifadə olunan heyvan modellərinin yaradılması da daxil olmaqla geniş tətbiq sahələrini dəstəkləyir.

DNT-nin qısa hissələrini səmərəli şəkildə birləşdirmək üçün elm adamları yapışqan uclar adlanan asılmış ardıcıllıqlara əsaslanırlar. Bu açıq hissələr DNT fraqmentlərinin bir-birinə bağlanmasına kömək edir. Lakin düzgün yapışqan ucların istehsalı müəyyən yerlərdə yüksək dəqiqliklə kəsmə tələb edir ki, bu da mövcud texnologiyaların həmişə yaxşı öhdəsindən gələ bilmədiyi bir şeydir.

Yaponiyadakı tədqiqatçılar indi gümüş nanopartiküllərindən istifadə edərək hədəf yerlərdə DNT-ni kəsib yenidən birləşdirən bir üsul hazırlayıblar. Bu üsul ənənəvi restriksiya fermenti metodları ilə əldə ediləndən iki-beş dəfə yüksək DNT yığma səmərəliliyi təmin edib. Nəticələr Nuklein Asitləri Tədqiqatında dərc edilib .

Ənənəvi DNT Yığıncağının Məhdudiyyətləri

Uzun DNT molekullarının yığılması üçün standart üsullar adətən kəsiklər yaratmaq üçün restriksiya fermentlərindən və yaranan fraqmentləri birləşdirmək üçün T4 DNT liqazından istifadə edir. Lakin restriksiya fermentləri yalnız müəyyən DNT ardıcıllıqlarını tanıya və kəsə bilir. Onlar həmçinin nisbətən qısa olan yapışqan uclar əmələ gətirirlər ki, bu da birləşmə prosesinin səmərəliliyini azalda bilər.

Naqoya Universitetində professor Hiroşi Abe və dosent Masahito İnaqakinin rəhbərlik etdiyi bir qrup, Gifu Universitetində professor Natsuhisa Oka ilə birlikdə alternativ axtararaq, kimyəvi reaksiyaların restriksiya fermentlərinə etibar etmək əvəzinə, seçilmiş yerlərdə DNT-ni kəsmək üçün istifadə edilə biləcəyini araşdırdı.

Tədqiqatçılar ilk dəfə 1990-1992-ci illər arasında bildirilən, gümüş ionlarının 3′-tiol ilə modifikasiya olunmuş DNT-ni müəyyən yerlərdə kəsdiyi reaksiyanı yenidən nəzərdən keçirdilər. Onlar bu reaksiyanın faydalı yapışqan uclar yaratmaq üçün istifadə edilə biləcəyini sınaqdan keçirdilər. Gümüş ionları DNT-ni kəsməkdə təsirli idi, lakin onlar həm də qeyri-spesifik şəkildə yapışırdılar və çöküntüyə səbəb olurdular. Nəticədə, DNT-nin yalnız təxminən 14%-i bərpa edilə bildi ki, bu da praktik tətbiqlər üçün çox azdır.

Gümüş Nanopartikülləri DNT-nin bərpasını yaxşılaşdırır

Komanda daha sonra gümüş ionlarını gümüş nanopartikülləri ilə əvəz etdi. Tədqiqatçılar nanopartiküllərin reaksiya qarışığından santrifüqləmə yolu ilə ayrıla biləcəyini və bunun sonradan DNT-nin bərpasını asanlaşdıra biləcəyini əsaslandırdılar.

İlkin təcrübələr göstərib ki, DNT parçalanma səmərəliliyi iki saat ərzində 70°C-də təxminən 50%-ə, 95°C-də isə demək olar ki, 100%-ə çatıb. Lakin bu temperaturlar uzun DNT molekullarına zərər verə bilər və bu da praktik istifadə üçün başqa bir maneə yaradır.

Bu problemi həll etmək üçün tədqiqatçılar nanopartikulların stabilliyini və dispersiyasını artırmaq üçün onları suda həll olan polietilen qlikol (PEG) ilə örtdülər. Örtük, DNT parçalanma səmərəliliyini PEG olmadan 36%-dən 37°C-də 31 saat ərzində PEG ilə 92%-ə qaldırdı. “Sonda biz şəraiti praktik səviyyəyə qədər optimallaşdırdıq və ətraf mühitin temperaturu altında cəmi bir-iki saat ərzində 50°C-də 91%-dən yuxarı PEG ilə modifikasiya olunmuş parçalanma səmərəliliyinə nail olduq”, – deyə tədqiqatın ilk müəllifi İnagaki bildirib.

Nanohissəcik yanaşması daha bir vacib üstünlük təmin etdi. İstənməyən DNT fraqmentləri nanohissəcik səthlərinə yapışmış vəziyyətdə qaldı, yapışqan ucları olan istənilən fraqmentlər isə məhlulun içində qaldı. Bu daxili təmizləyici effekt son DNT bərpa nisbətini 14%-dən 98%-ə qaldırdı.

Daha uzun yapışqan uclar DNT birləşməsini gücləndirir

Gümüş nanopartikülləri həmçinin tədqiqatçılara ənənəvi restriksiya fermentləri ilə əldə edilməsi çətin olan 8 əsaslı yapışqan uclu DNT fraqmentləri istehsal etməyə imkan verdi. Alimlər bu fraqmentləri birləşdirmək üçün T4 DNT liqazından istifadə etdikdə, birləşmə səmərəliliyi ənənəvi metodlarla müqayisədə təxminən iki dəfə yüksək idi.

Daha uzun çıxıntılarla irəliləyiş daha da artdı. 18 əsaslı çıxıntıdan istifadə edərək tədqiqatçılar 44% birləşmə səmərəliliyinə nail oldular. Müqayisə üçün, ənənəvi 4 əsaslı çıxıntı yalnız 8% səmərəlilik təmin etdi və yeni yanaşmaya beşqat üstünlük verdi.

Metodun praktik bioloji şəraitdə işləyə biləcəyini yoxlamaq üçün komanda yaşıl flüoresan zülalı (GFP) kodlayan bir DNT fraqmenti topladı. Daha sonra yığılmış DNT-ni insan HeLa hüceyrələrinə daxil etdilər. Hüceyrələr uğurla GFP ifadə etdi və DNT-nin dəqiq şəkildə yığıldığını təsdiqlədi.

Gen Terapiyası və Sintetik DNT-də Potensial İstifadələr

İnagaki şərhində bildirib ki, “Biz inanırıq ki, bu texnologiya genom DNT-sinin sintezi üçün faydalı olacaq və xərçəng peyvəndləri və gen terapiyası üçün mRNT kitabxanasının yaradılması, eləcə də süni protein dərmanlarının və genom bitkilərinin inkişafı kimi sahələrdə bir çox mümkün tətbiqlərə malikdir.”

Tədqiqatçılar indi texnikanın bir anda yalnız iki DNT fraqmentini birləşdirməkdən kənara çıxa biləcəyini müəyyən etmək istəyirlər. O, həmçinin növbəti addımı izah etdi: “Biz iki DNT fraqmentinin birləşdirilə biləcəyini göstərdik. İndi isə birdən çox fraqmentin eyni anda birləşdirilə biləcəyini təsdiqləməliyik – bu, genom miqyaslı DNT qurmaq üçün əsas addımdır.”